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做试验时需了解以下常识,避免产生不必要的损失
① 购买后,请务必查看标签上的注意事项;
② 做好防止倒置,摔坏的措施和办理体制;
③ 试剂在运用前再次确认标签上的注意事项,做好必要的安全对策;
④ 对没有标明其风险特性,有害特性的,也要慎重地进行操作;
⑤ 有必要戴好防护用具,小心谨慎进行操作;

准备物品:

清理液(A) 毫升

染色液(t B) 微升

稀释液(C) 毫升

溶解液(tD) 毫升

产品说明书 1份
注意事项:

1.基础程序。

2.扩增温度和延伸温度。

3.反应时间。

4.循环次数。

5.片PCR 反应液的配制。

6.PCR技术的基本原理。

7.PCR的反应动力学。

8.PCR扩增产物。

9.PCR反应体系与反应条件。
反应五要素:

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:

①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基,特别是末及倒数第2个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。